 |
 |
| Документы и бланки онлайн |
 |
Обследовать |
 |
 |
|
|
|
Структура бактеріальної клітини. Складні методи фарбування. Метод Грама. Капсули і спори, методи їх виявлення.
Актуальність теми: Кожний мікроорганізм має певні морфологічні структури та тинкторіальні властивості і знання цих властивостей, допомога&# 818g69ii 1108; в ідентифікації збудника. ═В цьому допомога&# 818g69ii 1102;ть складні методи фарбування, які дозволяють диференціювати═ одні бактерії від інших та вивчати структурні особливості бактеріальної клітини. Тому для ідентифікації кожен лікар повинен вміти фарбувати препарати та═ розрізняти в них різні форми основних груп мікроорганізмів.
═══════ Мета (загальна): уміти виявляти та розпізнавати різні структури мікроорганізмів═ при мікроскопіюванні забарвлених препаратів на склі. Конкретні цілі═══════════════════════════════════════════════════════════════════════════ Вихідний рівень Уміти:
Теоретичні питання: 1. Структура бактеріальної клітини: нуклеоїд, мезосоми, рібосоми, включення, цитоплазма, цитоплазматична мембрана, клітинна стінка, капсула, джгутики. Методи їх вивчення та виявлення. 2. Мета використання складних методів забарвлення в мікробіологічній практиці. 3. Складні методи фарбування мікроорганізмів. Метод Грама. Виявлення капсули (метод Буррі-Гінса). 4. Спороутворення у мікроорганізмів. Метод Циля-Нільсена для виявлення спор та кислотостійких бактерій.
При підготовці до заняття користуйтеся літературою: 1. Пяткін К.Д., Кривошеїн Ю.С. Мікробіологія. √ К.: Вища школа, 1992. √ С.═ 27 -38. 2. Пяткин К.Д., Кривошеин Ю.С. Микробиология. √ М.: Медицина, 1981. √ С. 4 - 26. 3. Борисов Л.Б. Медицинская микробиология, иммунология, вирусология.: МИА, 2002. √ С. 30 - 45. 4. Коротяев А.И., Бабичев С.А.. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология. √ С-Пб, 2002. √ ═С. 33 - 46. 5. Поздеев О.К. Медициская микробиология / Под ред. акад. РАМН В.И. Покровского. √ М.: ГЭОТАР √ 2001. √ ═С. ═17 √ 26, 113 √ 114. 6. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология: Учебник/ Под ред. А.А. Воробьева. √ М. Медицинское информационное агенство, 2004. √ С. 35 - 41. 7. Руководство к лабораторным занятиям по медицинской микробиологии /Под редакцией Л. Б. Борисова. √ М.: Медицина, 1993. √ С. 17 √ 19. 8. Клименюк С.І. Ситник І.О., Творко М.С., Широбоков В.П. Практична мікробіологія: Посібник. √ Тернопіль: Укрмедкнига, 2004. √ С. 19 √ 22. 9. Пояснення до самостійної роботи (додаток 1). 10. Графи логічної структури (додаток 2). ПРАКТИЧНА РОБОТА СТУДЕНТІВ 1. Вивчити і зарисувати демонстраційні препарати. 2. Приготувати препарат із суміші культур і пофарбувати його за Грамом. Мікроскопіювати, зарисувати. 3. Приготувати препарати із спорових і кислотостійких мікроорганізмів та пофарбувати їх за Цилем-Нільсеном. Мікроскопіювати, зарисувати в протоколі. 4. Прибрати робоче місце. 5. Оформити протокол і підписати у викладача.
Алгоритм практичної роботи Робота № 1 ══════ Вивчіть демонстраційні препарати, звернувши увагу на особливості═ морфологічних структур та тинкторіальні властивості бактерій. Препарати зарисуйте кольоровими олівцями, умовно позначивши поле зору у вигляді кола. Робота № 2 Методика приготування мазка із суміші═ мікроорганізмів. Для приготування мазка візьміть чисте знежирене предметне скло. На предметному склі позначте склографом місце нанесення матеріалу. Бактеріальну петлю прожарьте═ у полум▒ї дотримуючись усіх правил (див. зан 1 робота 4). Не випускаючи петлі, лівою рукою═ візьміть пробірку із рідиною, що містить суміш мікроорганізмів (Staphylococcus aures та═ Escherichia coli), а 4-м і 5-м пальцями правої руки═ затисніть ватно-марлеву пробку, витягніть її, і вінця пробірки пронесіть через полум▒я спиртовки, не випускаючи пробки. Петлю введіть в пробірку і охолодіть її, торкаючись стінки пробірки.═ Занурюючи петлю в рідину , наберіть═ краплю суміші мікроорганізмів. Вийміть петлю, проведіть пробку та відкритий край пробірки через полум▒я спиртовки, після чого═ її закрийте═ і поставте у штатив. На центр скельця═ бактеріологічною петлею нанесіть краплю рідини, що містить суміш мікроорганізмів, яку═ розітріть рівномірно═ на поверхні скла діаметром в межах 1 √ 1,5 см. Мазок висушіть на повітрі і зафіксуйте над полум▒ям спиртовки. Готовий препарат зафарбуйте методом Грама (методика фарбування за Грамом див. нище). Далі використовуючи═ імерсійну мікроскопію промікроскопіюйте пофарбований препарат та вивчіть його ( див. зан. 1 робота 3 ).
Техніка фарбування за Грамом (модифікація Синьова). 1. На фіксований мазок покладіть суху смужку фільтрувального паперу, який раніше був просочений розчином генціанвіолету. Нанесіть на папір 2-3 краплі води. Час фарбування 2 хвилини. 2. Зніміть папір. 3. Обробіть розчином Люголя протягом 1 хвилини. 4. Для знебарвлювання нанесіть на препарат спирт на 30 секунд. 5. Промийте препарат водою. 6. Для додаткового фарбування налийте на препарат фуксин Пфейфера (водний розчин)═ на 1 хвилину. 7. Промийте препарат водою та просушіть фільтрувальним папером.
Препарати замальовуйте кольоровими ручками, умовно позначивши поле зору у вигляді кола. Мікроскопічна картина: при правильному забарвленні грампозитивні Staphylococcus aures ═фарбуються в темно-фіолетовий колір,═ грамнегативні бактерії - Escherichia coli-у рожевий. Фарбування за Грамом є важливим методом для диференціації різних видів мікроорганізмів за тинкторальними властивостями. Грампозитивні мікроорганізми══ (наприклад, Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes) фарбуються у фіолетовий колір (генціанвіолетом), грамнегативні (наприклад, ═Escherichiа сoli, Salmonella typhi) - у червоний (фуксином). Для отримання вірних результатів необхідно точно виконувати правила приготування мазка, тривалість фарбування та знебарвлюваності ═спиртом. Товсті, густі мазки будуть фарбуватися нерівномірно, так грамнегативні бактерії можуть пофарбуватися грампозитивно. Крім того, має значення вік культури та мінливість мікроорганізмів. Грамнегативні бактерії в старих культурах можуть пофарбуватися грампозитивно. Робота 3 Техніка приготування препарату з кислотостійких═ чи спороутворюючих бактерій аналогічна минулій (дивись роботу 1). Техніка фарбування═ за Цилем-Нільсеном. 1. На фіксований препарат покладіть суху смужку фільтрувального паперу, нанесіть на папір 3-4 краплі карболового фуксину Циля. Утримуючи предметне═ скельце пінцетом, або рукою, тричі нагрійте препарат над полум'ям спиртівки до появи пари. Час фарбування - 5 хвилин. Після охолодження скельця зніміть фільтрувальний папір з препарату та промийте його водою. 2. Для знебарвлювання нанесіть на препарат 5% розчин сірчаної кислоти на 30 секунд. 3. Ретельно промийте препарат водою. 4. Нанесіть на мазок декілька крапель водного розчину метиленового синього на 3-4 хвилинию 5. Промийте препарат водою та просушіть фільтрувальним папером.═ Спороутворюючі мікроорганізми фарбуються за Грамом позитивно. Але спора при цьому способі не фарбується внаслідок особливостей структури (щільна оболонка) і хімічного складу (високий вміст ліпідів) та визначається у ввигляді безбарвного утворення на фоні фіолетової цитоплазми. Препарати замальовуйте кольоровими ручками, умовно позначивши поле зору у вигляді кола. Мікроскопічна картина: При фарбуванні Bacillus anthracis (збудники сибірки, що мабть спору) за═ Цилем-Нільсеном спора фарбується у червоний колір фуксином Циля, не знебарвлюючись при обробці препарата сірчаною кислотою. Знебарвлена ж цитоплазма клітини дофарбовується метиленовим синім в блакитний колір. При фарбуванні за Цилем-Нільсеном спора сприймає барвник, оскільки при прогріванні препарата та дії концентрованого розчину фуксина Циля відбувається збільшення проникливості оболонки спори. Внаслідок кислотостійкості спора не знебарвлюється при наступній обробці сірчаною кислотою. Фарбування за Цилем-Нільсеном використовується також для диференціації кислотостійких та некислотостійких═ мікроорганізмів. Стійкість бактерій, наприклад═ Mуcobacterium tuberculosis, до кислоти зумовлена підвищеним вмістом в клітинній стінці і цитоплазмі ліпідів, воску та оксікислот. Принцип заснований на тому, що═ кислотостійкі бактерії за рахунок═ вказаних речовин стійко зв'язують═ карболовий фуксин при нагріванні (тобто фарбуються в червоний колір) і не знебарвлюються═ сірчаною кислотою,═ при використанні додаткового барвника═ - метиленового═ синього √ загальний фон фарбується в голубий колір. Робота 4 По закінченні роботи необхідно прибрати робоче місце. 1. Приведіть у належний вигляд мікроскоп.═ Для цього підніміть тубус, зніміть препарат, витріть імерсійну олію з об'єктиву чистою марлевою серветкою, опустіть конденсор, переведіть револьвер в нейтральне положення і опустіть тубус. 2. Вилийте воду з ваночки для промивання препаратів. 3. Поставте пробірки з культурами в загальний штатив на демонстраційному столі. 4. Скельця з препаратами, що приготовлені та пофарбовані правильно, залиште для колекції на залікове заняття №1. 5. Не потрібні використані скельця з препаратами опустіть в емкість з дезрозчином. 6. Наведіть загальний порядок на столі. 7. Зробіть заключну дезінфекцію робочого столу (протріть стіл дез. розчином). 8. Вимийте руки з милом і при необхідності обробіть дез. розчином. Робота 5 Протокол═ практичної роботи═ слід оформлювати за═ наступною схемою: 1. Запишіть поставлену задачу дослідження (вона вказана в кожній роботі в розділі "Практична робота"). 2. Дайте опис ходу роботи. 3. При мікроскопічному вивченні препарату результати занесіть в протокол у вигляді рисунка з повною назвою об'єкту (латиною). 4. Зробіть заключення по кожному проведеному дослідженню. Протокол подають на підпис викладачу після прибирання робочого місця. Демонстрація 1. Препарати Сorynebacterium diphtheriae та Bordetella pertussis пофарбовані методом Грама. В демонстрації представлені препарати, які відрізняються за тинкторіальними властивостями. Збудник дифтерії (Сorynebacterium diphtheriae) уявляє прямі або трохи зігнуті палички довжиною 1,0 √ 0,8 мкм. Спор та капсул не уворює. Фарбується за Грамом позитивно. Треба зауважити, що характерною диференціальною ознакою для збудника дифтерії є волютинові зерна. При характерному розташуванні паличок під кутом один до одного зерна волютину С.diphtheriae═ при фарбуванні за Грамом виявляються у вигляді потовщень на кінці паличок. Збудник кашлюку (Bordetella pertussis)═ √ дрібна з закругленими кінцями паличка за Грамом фарбується негативно. Здатність бактерій фарбуватися═ за Грамом═ залежить від властивостей та хімічного═ складу клітинної стінки та цитоплазматичної мембрани. Грампозитивні бактерії мають трьохшарову клітинну стінку, в якій відсутні ароматичні та серовмісни кислоти, відзначається низький вміст ліпідів. У грамнегативних бактерій клітинна стінка двошарова, і ці речовини вміщуються в невеликій кількості. Крім того в клітинах грампозитивних бактерій вміщується значно більше РНК √ співвідношення РНК:ДНК у грампозитивних бактерій (приблизно) 3:1, а у грамнегативних √ 1:1. На поверхні цитоплазми клітини у грампозитивних мікроорганизмів розташовується комплекс з білка та рибонуклеїна магнія, відсутній у грамнегативних бактерій.═ При фарбуванні на поверхні грампозитивних клітин утворюється═ міцний комплекс рибонуклеата магнія, генціанвіолета та йода, який не руйнується при обробці спиртом. Має значення і різниця в кислотно-лужних властивостей цитоплазми, бо ізоелектрична точка грампозитивних мікроорганізмів близка до рН2, а у грамнегативних рН5.═ Після обробки йодом значення рН грампозитивних видів ще більше знижується, що створює умови для міцної фіксації барвника (генцианвіолет). 2. Klebsiella pneumoniaе (фарбування за Буррі-Гінсом). Сама техніка фарбування бактерій, що мають капсулу, за Буррі-Гінсом полягає в наступному. ═════ Змішують краплю завісі мікробних клітин з краплею чорнила і за допомогою скла з шлифувальним краєм робиться мазок тким же чином, як мазок крові, який висушують та фіксують. Потім на препарат наносять водний розчин фуксину на 1- 2 хвилини. Промивають його водою, висушують на повітрі і мікроскопіюють. ═════ При такому фарбуванні на темному димчасто-сірому фоні контрасно виділяються незабеарвлені капсули, всередені яких знаходяться яскраво-червоні тіла бактерій.═ 3. Clostridium tetani (збудник правцю), фарбування за Цилем-Нільсеном. Збудник правця має вигляд барабанної палички═ (внаслідок термінально розташованої спори, діаметр якої перевищує поперечник клітини), цитоплазма клітин пофарбована в блакитний колір, спори √ в рубіново-червоний (механізм фарбування спор за Цилем-Нільсеном див. робота 2). 4. Вacillus anthracis (збудник сибірки), фарбування за Цилем-Нільсеном. У мазку видно, що вегетативні форми забарвлені в синій колір, спори √ у червоний, це пов▒язано з хімічним складом різних структур бактерії. Цільові навчальні═ завдання 1. Для структури═ клітинної стінки═ бактерій характерні всі нищеперелічені властивості, КРІМ: А.═ вміщує складний полімер пептидоглікан В. будова відповідає за здатність═ сприймати фарбування за Грамом С. уявляє собою унікальну гнучку та пластичну структуру Д. містить d-ізомерази амінокислот Е. клітинна стінка грамнегативних бактерій більш чутлива до дії лізоциму, ніж═ стінка грампозитивних бактерій 2. Яка з перерахованих структур клітинної стінки бактерій визначає здатність бактерій прикріплятися до поверхні клітин? А. Капсули В. Джгутики С. Мікроворсинки (адгезини) Д. Мезооми Е. Ніякі з вказанних вище 3. При огляді дитини 6 років лікар помітив на глоткових мигдаликах сірувату плівку. Мікроскопія препаратів, з матеріалу взятого на ═межі здорової та ушкодженої ділянок слизової та пофарбованих за Нейссером показала наявність корінебактерій дифтерії. Яка морфологічна особливість була найбільш суттєвою для встановлення видової приналежності збудника?═ А. Полярно розташовані гранули волютину═ В. Локалізація збудника всередині макрофагів═ С. Наявність спор, діаметр яких перевищує діаметр клітини═ Д. Розташування клітин збудника у вигляді "штакетника"═ Е. Наявність капсули═ 4. На практичному занятті з мікробіології студентам запропоновано пофарбувати готові зафіксовані препарати ═із харкотиння хворого на туберкульоз. Який метод фарбування треба використати у данному випадку?══ А. Циля-Нільсена══ В. Буррі═ С. Романовського -Гімза═ Д. Гінса═ Е. Грама═ 5. У посіві з мигдалин у хворого на ангіну знайдено кулясті форми мікроорганізми, розташовані═ короткими ланцюжками. Які мікроорога&# 818g69ii 1085;ізми виявлено? А. Стафілококи В. Стрептококи С. Диплококи Д. Мікрококи Е. Тетракоки 6. Основні═ відмінності складних методів фарбування від простих? А. Використання одного барвника В. Використання декількох═ барвників С. Використання додаткових═ інгридієнтів, які не мають══ забарвлюючих властивостей Д. Не використовуються додаткові інгридієнти, що не мають забарлюючих властивостей Е. Жодна вище перелічена відповідь не правильна 7. Які структури бактеріальної клітини вважаються обов▒язковими? А. Нуклеоїд В. Цитоплазма С. Спора Д. Капсула Е. Клітинна стінка 8. Кислотостійкість бактерій═ пов▒язана: А. з ліпідами В. з оксікислотами С. з пептідогліканом Д. з наявністю включень 9. Яким складним методом фарбування можна виявити капсулу у бактерій? А. Методом Грама В. Методом Циля-Нільсена С. Методом Буррі-Гінса Д. Методом Романовського-Гімзи Е. Фарбуванням метиленовим синім 10. За допомогою яких методів можливе дослідження═ бактерій в живому стані? А. Методом └висячої■ краплі В. Методом═ Лефлера С. Методом Грама Д. Методом └розчавленої■ краплі ═ ═
Технологічна карта заняття
Додаток 1 ПОЯСНЕННЯ ДО САМОСТІЙНОЇ РОБОТИ З ТЕМИ: "Структура бактеріальної клітини. Складні методи фарбування. Метод Грама. Капсули і спори, методи їх виявлення."
Додаток 2 Графи логічної структури теми: "Структура бактеріальної клітини. Складні методи фарбування. Метод Грама. Капсули і спори, методи їх виявлення."
|
