Технология рекомбинантных ДНК
создание документов онлайн
Документы и бланки онлайн

Обследовать

Администрация
Механический Электроника
биологии ботаника
география
дом в саду
история
литература
маркетинг
математике
медицина
музыка
образование
психология
разное
художественная культура
экономика





















































Технология рекомбинантных ДНК

биологии



Отправить его в другом документе Tab для Yahoo книги - конечно, эссе, очерк Hits: 1549



дтхзйе дплхнеофщ

Клітинна імунна відповідь. Імунологічна толерантність. Регуляція імунної відповіді.
Підсумкове заняття з розділу „Нормальна мікрофлора організму людини. Вчення про інфекцію. Імунітет”
Природные биологически активные нуклеотиды
НЕРВНАЯ СИСТЕМА ЛАНЦЕТНИКА
Сверхспирализованная ДНК. Топоизомеразы
Особенности строение ДНК вирусов, бактерий, митохондрий
Амплифицированные ядрышки
Виды переноса генетической информации
Первичная структура нуклеиновых кислот
 

Технология рекомбинантных ДНК

Основные понятия и определения.

•         Нативная ДНК (клонируемая ДНК, встраиваемая ДНК, ДНК-мишень, чужеродная ДНК)

•         Другая ДНК для встраивания чужеродной ДНК (вектор для клонирования, клонирующий вектор)

•         рекомбинантная ДНК - конструкция «клонирующий вектор–встроенная ДНК»

•         Клетка-хозяин (реципиент) – клетка, в которую встраивают рекомбинантную ДНК

•         Трансформация – процесс получения клеток с рекомбинантной ДНК (трансформированных клеток), способных к репликации этой ДНК 

•         Ферменты рестрикции (рестриктазы)

Основные этапы получения продукта методами генной инженерии



•         Работы в области генетической инженерии включают четыре основных этапа:

•         1) получение нужного гена;

•         2) его встраивание в генетический элемент (вектор), способный к репликации;

•         3) введение гена, входящего в состав вектора, в организм-реципиент;

•         4) идентификация (скрининг и селекция) клеток, которые приобрели желаемый ген (гены).

 

Выделение ДНК.

·        Быстрый лизис клеток

·        Удаление фрагментов клеток и (или) клеточных органелл и мембран с помощью центрифугирования

·        Ферментативное разрушение белков протеинкиназами

·        Экстрагирование ДНК из раствора с помощью фенола и хлороформа

·        Осаждение ДНК этанолом

·        Растворение в буфере

При выделении ДНК клетку необходимо разрушить и высвободившиеся нуклеиновые кислоты очистить от других клеточных компонентов, при этом важно защитить ДНК от действия клеточных нуклеаз и максимально сохранить ей целостность.

Плазматическая мембрана клетки разрушается под действием детергентов, например, SDS или ферментов, например, лизоцима.

Обработка экстракта фенолом приводит к денатурации белков, но не ДНК.

Очистка от низкомолекулярных примесей осуществляется высаливанием ДНК этанолом, при этом низкомолекулярные вещества остаются в растворе.

К полученному препарату, как правило, добавляют хелатирующие агенты (хелаты – это комплексы Me с органич.), например ЭДТА, что предотвращает воздействие клеточных нуклеаз на ДНК из-за связывания катионов магния (Mg2+) с ЭДТА.

Ионы Mg2+ участвуют в процессах связывания ферментов с ДНК. Методы выделения плазмидной и хромосомной ДНК имеют некоторые различия, т.к. хромосомная ДНК по размерам намного больше плазмидной и выделяется в виде фрагментов линейных молекул, а плазмидная – в виде ковалентно замкнутых кольцевых молекул.

Хромосомную ДНК сложно выделить в неизменном виде, т.к. длинные молекулы ДНК легко подвергаются механическим разрушениям, поэтому хромосомная ДНК выделяется в виде фрагментов. Большинство методов выделения плазмидной ДНК включают осаждения, при которых удаляются преимущественно длинные цепи хромосомной ДНК. Многие методики основаны также на использовании свойств кольцевой замкнутой ДНК. Каждая из комплементарных цепей плазмидной ДНК представляет собой замкнутое кольцо, поэтому цепи невозможно отделить друг от друга, не разорвав одну из них, при этом можно подобрать условия, при которых водородные связи хромосомной ДНК разрушаются, например, при нагревании или выдерживании в умеренно-щелочных растворах. При охлаждении или нейтрализации кольцевые молекулы ДНК принимают нативную конформацию, а хромосомныеДНК остаются денатурированными. Чем меньше плазмида, тем легче провести её выделение. Выделение плазмид, размер которых больше 20 пар нуклеотиднов проходит с низким выходом и не всегда удачно.

Оценка качества экстрагируемой ДНК.

·        Измеряют оптическую плотность раствора при 280 нм и 260нм




·        Чистые образцы ДНК имеют соотношение оптических плотностей 260/280 нм больше 1,8

·        Визуализация фрагментов ДНК методом электрофореза в агарозном геле (с эдитием бромида)

·        При 260 – 280 нм поглощают ароматичные соединения, а гетероциклические основания при других

Ферменты рестрикции.

Дляя определения нуклеотидной последовательности больших фрагментов ДНК их необходимо расщепить. Для этого используют специальные фрагменты – рестриктирующие эндонуклеазы (рестриктазы). Эти ферменты бывают двух типов: расщепляют ДНК с образование «липких концов» и с  образованием «тупых концов».

Палиндромные последовательности, которые распознаются рестриктазами, и в которых происходит расщепление молекулы ДНК, называется сайтами узнавания. Выделено большое количество рестриктаз, как правило, из бактериальных клеток. В названии рестриктаз обозначают прописной буквой род микроорганизма, двумя строчными буквами – вид, а римскими цифрами порядковый номер этой рестриктазы, выделенной из данного микроорганизма. Например, EcoRI.

Расщепление рестриктазами ДНК имеет применение не только для определения нуклеотидной последовательности больших молекул ДНК, но и при получении рекомбинантных ДНК.

Когда два разных образца ДНК обрабатывают одной и той же рестриктазой с образованием ферментов с липкими концами, а затем смешивают эти образцы, то благодаря комплементарному спариванию липких концов фрагментов разных образцов могут образоваться новые комбинации ДНК – рекомбинантные ДНК. Однако, комплементарности липких концов не достаточно для удержания двух субъединиц фрагментов ДНК, необходимо образование ковалентной связи в местах разрыва одноцепочеченой ДНК. Образование фосфодиэфирной связи катализирует фермент ДНК-лигаза, которую выделили из бактериофага Т4 (ДНК-лигаза Т4).

Для использования рекомбинантной ДНК в молекулярном клонировании необходимо, чтобы эта молекула содержала не только специфический ген, который нужно клонировать, но и была способна к репликации в клетке хозяина, т.е. должна содержать информацию, необходимую для репликации рекомбинантной ДНК, поэтому для получения рекомбинантной дНК используют стандартные молекулы ДНК – клонирующие векторы.

Плазмидные векторы. Плазмиды – это внехросомомные автономно реплицирующиеся двуцепочечные кольцевые молекулы ДНК

Для клонирования более молекул ДНК используют бактериофаг λ. После проникновения бактериофага λ в клетку Eoli события могут развиваться по двум разным направлениям: 1)литический цикл (фаг начинает интенсивно размножаться и через 20 мин клетка лизирует с высвобождением 100 новых фаговых частиц); 2) состояние лизогении – фаг включается в хромосомную ДНК E.coli как профаг и реплицируется в клетке вместе с нормальными бактериальными генами, однако при недостатке питательных веществ и при других неблагоприятных условиях интегрированном фаговым ДНК высвобождаются и запускается литический цикл.

Вектором лля клонирования – космиды. Космиды объединяю свойства плазмидных векторов и векторов на основе фага λ. Эти векторы могут включать в чужеродную дНК до 40 тыс. пар нуклеотидов.

На основе плазмиды и встраиваемой ДНК получают нециклическую рекомбинантную ДНК, которая затем упаковывается в белковую оболочку в виде фаговых частиц. Оказавшись в бактериальной клетке рекомбинантная ДНК замыкается в кольцо благодаря наличию специфических участков от плазмиды.