 |
 |
| Документы и бланки онлайн |
 |
Обследовать |
 |
 |
|
|
|
БАКТЕРІОФАГИ. ГЕНЕТИКА БАКТЕРІЙ.
Актуальність теми: Вивчення генетики бактері 616f56bg й та бактері 616f56bg офагів═ необхідно═ для знання═ механізмів передачі патогенних властивостей═ і стійкості═ мікроорганізмів до═ лікарських препаратів. Генетичні═ маркери мікроорганізмів викорисовуються для═ діагностики═ інфекційних захворювань. Мета═ (загальна):═ Уміти використовувати в медичній практиці═ бактері 616f56bg офаги та оцінювати═ результати генетичних методів діагностики. Конкретні цілі═══════════════════════════════════════════════════════════════════════════ Вихідний рівень Уміти:
Теоретичні питання: 1. Природа та властивості бактері 616f56bg офагів. 2. Вірулентні та помірні фаги. Механізми═ їх взаємодії з бактері 616f56bg альною клітиною. 3. Використання бактері 616f56bg офагів (фагоідентифікація, - індикація, -профілактика, - терапія). 4. Форми мінливості мікроорганізмів. Фенотипова мінливість. 5. Генотипова мінливість (мутації та генетичні рекомбінації). 6. Плазміди √ позахромосомні фактори спадковості. 7. Практичне значення вчення═ про генетику мікроорганізмів. 8. Принципи генетичних методів діагностики інфекційних захворювань. 9. Основні принципи═ генної інженері 616f56bg ї. При підготовці до заняття користуйтеся літературою: 1. Мікробіологія К. Д. Пяткін, Ю. С. Кривошеїн. √ К.: Вища школа, 1992. √ с.═ 28 - 39. 2. Борисов Л.Б. Медицинская микробиология, иммунология, вирусология.: МИА, 2002. √ с. 84 √ 120. 4. Коротяев А.И., Бабичев С.А.. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология. √ С-Пб, 2002. √ с. 85 - 106. 5. Поздеев О.К. Медицинская микробиология / Под ред. акад. РАМН В.И. Покровского. √ М.: ГЭОТАР √ 2001. √ с. ═. 6. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология: Учебник/ под ред. А.А. Воробьева. √ М.Медицинское информационное агенство, 2004. √ С. 104 - 115. 7. Руководство к лабораторным занятиям по медицинской микробиологии /Под редакцией Л. Б. Борисова. √ М.: Медицина, 1993. √ С. 54 √ 59. 8. Клименюк С.І. Ситник І.О., Творко М.С., Широбоков В.П. Практична мікробіологія: Посібник. √ Тернопіль: Укрмедкнига, 2004. √ С. 111 - 113 . 9.═ Лекції для студентів. 10. Пояснення до самостійної роботи (додаток 1). 11. Графи логічної структури (додаток 2). ПРАКТИЧНА РОБОТА СТУДЕНТІВ 1. НДРС. ІІ етап виділення чистої культури ═анаеробних бактері 616f56bg й з грунтової бовтушки. 1.1. Опишіть культуральні властивості анаеробних бактері 616f56bg й на середовищі Кітта-Тароцці. 1.2. Зробіть препарат з культури, що вирощена на середовищі Кітта-Тароцці, пофарбуйте його за Грамом, промікроскопіюйте. 2. Вивчити та зарисувати демонстрації. 3. Прибрати робоче місце. 4. Оформити протокол заняття═ та підписати його у викладача.
Алгоритм практичної роботи Робота 1.1. На першому етапі═ виділення чистої культури анаеробних бактері 616f56bg й був зроблений посів грунтової бовтушки на середовище Кітта-Тароцці. Ці посіви інкубували в термостаті. На другому етапі ви повинні═ охарактеризувати зміни, що наявні в середовищі накопичення: поява змутнення або змутнення та газоутворення. Результати внесіть═ в протокол. Робота 1.2. Набері 616f56bg ть бульонну культуру═ піпеткою, занурюючи═ її через шар вазелінової олії до дна пробірки. Витягніть піпетку, олію з поверхні стінок витріть стерильною═ ватою за допомогою пінцету над ємкістю з дез.розчином. Мазки приготуйте═ на склі звичайним способом, закфіксуйте їх над полум▒ям спиртівки і пофарбуйте за Грамом. При мікроскопії═ реєструйте наявність грампозитивних паличковидних форм (зі спорами або без спор). Результати мікроскопії внесіть в протокол. Демонстрація 1. Реакція наростання титру фага. Принцип цієї реакції полягає в тому, що до дослідного матері 616f56bg алу═ додають певну кількість═ індикаторного (специфічного) фага і становлять в термостат. Якщо в дослідному═ матері 616f56bg алі═ знаходяться бактері 616f56bg ї, відповідні внесеному фагу, кількість корпускул фага збульшується, в протилежному випадку═ титр бактері 616f56bg офага буде дорівнювати вихідному. Результат реакції внесіть в протокол, напишіть висновок. 2. Титрування бактері 616f56bg фага═ за методом ═Граціо. ═ Титрування фага за Граціо дозволяє═ провести═ точне врахування═ активності═ препарату, тобто кількість═ фагових часток в 1 мл досліджуваної рідини.═ Цей метод заключався в наступному. До бульонної культури═ стафілокока (0,5 мл) додали 1 мл бактері 616f56bg офагу в розведенні 10-4, ретельно перемішали══ і залишили на 5 хвилин═ для адсорбції бактері 616f56bg офагу на бактері 616f56bg альній клітині. Потім 0,5 мл═ розплавленого═ напіврідкого═ агару (0,7%) додали═ до суміші двох культур, перемішали═ і вилили другим шаром в чашку Петрі з 1,5% агаром. Як═ тільки агар═ застигнув, чашку поставили в термостаті при температурі 370 С на 7-8 годин. Далі потрібно підрахувати кількість негативних колоній, кожна з яких═ виникла в результаті═ розмноження однієї фагової частинки. Для визначення титру══ бактері 616f56bg офагу за Граціо═ потрібно отриману кількість негативнийх колоній помножити═ на розведення. Наприклад, якщо фаг (в обмі 1 мл)═ з розведенням 10-4 дав на чашці 7 негативних колоній, то титр фага = 7х10-4 фагових часток в 1 мл нерозведенного субстрату. Результат досліду внесіть в протокол, напишіть висновок. 4. Фаготипування бактері 616f56bg й √ дозволяє визначити видову приналежність або═ фаготип досліджуваної культури. Воно має і епідеміологічне значення, дозволяючи встановити джерело═ і шляхи розповсюдження інфекції. 4.1. Фаготипування за Фіщером. Постановка цього досліду заключалася в наступному. Дно чашки Петрі з МПА розчерчували на квадрати. Проводили посів досліджуваної культури бактері 616f56bg й газоном. Через 5-10 хвилин після═ посіву на підсушену поверхню═ живильного середовища в певні квадрати наносили═ взвісь стандартних бактері 616f56bg офагів по 1 краплі. Після інкубації при температурі 370 С протягом 18-24 годин з▒явилися зони відсутності росту бактері 616f56bg й (лізису) у випадку співвідношення бактері 616f56bg альної культури та внесеного бактері 616f56bg офага. Результат досліду внесіть в протокол, напишіть висновок. 4.2. Фаготипування за Фюртом. ═1 мл бактері 616f56bg офага вносили в 20 мл розплавленого та охолодженого═ до 45С МПА. Суміш стерильно вилили чашку Петрі і залишили═ для засгання.═ Поділили дно чашки склографом на чотири═ сектори. В кожний сектор═ засіяли═ одну з чотирьох досліджуваних бульонних культур бактері 616f56bg й. Чашку поставили в термостат при 370 С на 18-24 години. Після 24 годин інкубації═ треба враховати результат. Відсутність росту бактері 616f56bg й в якомусь з секторів свідчить═ про співідношення═ стандартного бактері 616f56bg офагу дослідної культури і про приналежність═ культури до даного фаготипу. Результат досліду внесіть в протокол, напишіть висновок. 5. Метод Отто. Постановка цього досліду заключається у наступному.═════ В чашку Петрі═ розлили═ 1,5% МПА. Після застивання чашку засіяли═ густим газоном 16-18 годинною бульонною культурою, гомологічною вихідному фагу і через 16-18 хвилин посіву на висушену═ поверхню═ живильного середовища наносили краплями дослідний фільтрат (фаг). На одній чашці можна═ поставити декілька проб. Для цього чашку═ поділили на═ сектори і в кожний═ сектор вносили═ по краплині фільтрату. Після того як фаг дифундує═ в середовище, чашки перевернули у верх дном, підписали, поставили в термостат═ при температурі 370 С на 18-24 години. Врахування досліду проводили за: а) повною відсутністю росту культури в місці═ нанесення краплі фільтрату (активний бактері 616f56bg офаг); б) наявністю═ мілких стерильних плям-колоній бактері 616f56bg офагу (бактері 616f56bg офаг слабої активності). Результат досліду внесіть в протокол, напишіть висновок. 6. Дослід по виявленню множинної═ стійкості до антибіотиків. ═ Техніку постановки дивись в занятті №4 демострація №10. Резистентність до антибіотиків, яка зумовлена═ наявністю R-фактору (фактору резистентності) та RTF (Resistance transfer factor) √ трансмісивним епісомним фактором, що переносить r-фактори.═ RTF передається═ від одніх бактері 616f56bg й до інших при кон▒югації. Ці фактори розповсюджені═ серед кишкової родини бактері 616f56bg й, коків та уявляють собою молекулу═ ДНК, що має═ кільцеву будову. Біохімічні механізми, які зумовлюють═ множинну лікарську резистентність, зв▒язують═ з═ зменшенням проникненості═ клітинної стінки, цитоплазматичої мембрани для лікарських═ речовин.═ На демонстраційній чашці видно, що навколо дисків з антибіотиками відсутня зоня затримки росту бактері 616f56bg й. Це свідчить про те, що бактері 616f56bg ї мають множинну стійкість до антибіотиків. Результат досліду внесіть в протокол, напишіть висновок. 6. Дослід═ трансдукції. Відомо, що передача мателіалу від одніх═ бактері 616f56bg й іншим за допомогою═ фагів. Для постановки═ досліду трансдукції узяли: 1. Помірний колі-фаг, отриманий при опроміненні ультрафіолетовими променями═ культури донора лактозопозитивної культури E. coli═ lac+. 2. Культура реціпієнта E. coli═ lac- (лактозонегативна). 3. Середовище Ендо як селективне середовище з лактозою для виявлення═ лактозопозитивних рекомбінантів E. coli . Методика постановки досліду: До 1 мл══ бульонної культури реціпієнта═ (E. coli═ lac-) додали 1 мл фага.══ Пробірку поставили═ на 40 хвилин в термостат. Потім зробили═ висів═ петлею═ на чашку Петрі з середовищем Ендо. Для═ контролю═ зробили висів═══ з пробірки═ з культурою реціпієнта.═ Результати досліду, що очікуються:═ при завершеній═ специфічній трансдукції разом═ з помірним═ фагом═ в клітину══ реципієнта═ потрапляє═ і фрагмент═ хромосоми═ донорської культури═ з геном, що контролює═ синтез лактози. При перетворенні═ помірного═ фагу═ в профаг═ разом з ним в хромосому═ реципієнта включається═ і цей ген. Як видног з демонстрації,═ на середовищі═ Ендо═ поряд з материнськими═════ лактозопозитивними═ колоніями ═══виросли і рекомбінанти у вигляді колоній червоного кольору. Результат досліду внесіть в протокол, напишіть висновок. 7.Дослід кон▒югації. Кон▒югація √ перенос═ генетичного матері 616f56bg алу з клітини донора в клітину реціпієнта через кон▒ягативний місточок. Для досліду═ кон▒югації═ узяли: 1. Культура донора E. coli Her, Pro+, Ura+, His+, Strs. Ця культура═ має фактор фертильності, що інтегрований═ в хромосому і є прототрофною (здатний до синтезу проліну, урацилу, гістідіна, але чутлива до стрептоміцину). 2. Культура реціпієнта E. coli F-, Pro-, Ura-, His-, Strr. Ця═ культура ауксотрофна по відношенню до проліну, урацилу, гістідіну, але резистентна до═ стрептоміцину. 3. Селективне середовище для виявлення═ рекомбінантів: синтетичне мінімальне середовище без═ амінокіслот та зі стрептоміцином в концентрації, що═ затримує ріст культури донора. Методика постановки досліду: До 2 мл═ культури реціпієнта додали 1 мл культури донора. Посіви═ поставили в термостат при температурі 370 С═ на 10 хвилин.═ Після інкубації зробили посів═ з дослідної пробірки на селективне середовище і на це ж середовище═ на сектори═ посіяли═ для контролю культури донора та реціпієнта. При кон▒гації з клітини донора в клітину реціпієнта через протоплазматичний місточок переходить═ фрагмент═ хромосоми═ донора з генами, що контролюють═ синтез проліну, гістидіну, урацилу. Утворюються рекомбінанти батьківських═ культур, що здатні═ до росту═ на мінімальному середовищі зі стрептоміцином═ (E. coli F-, Pro+, Ura+, His+, Strr). 8.Дослід трансформації. Трансформація √ безпосередня передача генетичного матері 616f56bg алу═ (фрагменту ДНК)═ донора реціпієнтній клітині. Для постановки досліду трансформації═ стійкості до стрептоміцину взяли: 1. Культуру реціпієнта √ золотистий стафілокок, що чутливий до стрептоміцину. 2. ДНК, що виділена з культури донора, стафілококу, що стійкий до стрептоміцину. 3. Селективне середовище √ МПА зі стрептоміцином. Методика постановки досліду: В стерильну пробірку налили 1 мл бульонної культури═ реціпієнта та 1 мл розчину ДНК донора (1мкг). Суміш поставили в термостат на 40 хвилин при температурі 370 С. Потім висіяли петлею на селективне середовище вміст з дослідної пробірки (після трансформації) та для═ контролю з пробірки з культурою═ реціпієнта.═ ДНК донора, проникаючи в компетентні клітини реціпієнта, включається в хромосому═ і передають═ ген стійкості═ до стрептоміцину, рекомбінантам, які дають ріст колоній═ на МПА═ зі стрептоміцином. Якщо ж ДНК донора перед додаванням до культури реціпієнта обробити дезоксірібонуклеазою, то трансформуючий фактор не передає спадкових властивостей донора.═ Трансформуються, як правило, окремі властивості, але іноді══ одночасно декілька═ ознак в зчепленому стані. Результат досліду внесіть в протокол, напишіть висновок. Зверніть увагу, що в дослідах═ кон▒югації та трансформації контрольні посіви на селективних═ середовищах стерильні. На середовищах з антибіотиками спостері 616f56bg гається═ ріст колоній рекомбінантів. В досліді трансдукції в контрольному посіві видно ріст безбарвних колоній E. coli lac-, а після═ досліду═ трансдукції на чашці серед безбарвних колоній═ є і колонії═ червоного кольору √ це рекомбінанти E. coli lac+. 9.Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР). В основі метода ПЛР покладено унікальну властивість НК (як ДНК, так і РНК) √ здатність до саморепродукції, яка відтворюється штучно in vitro. При═ цьому синтезуються тільки суворо специфічні фрагменти НК. У зв▒язку з цим, перш ніж═ проводити ПЛР, необхідно узнати нуклеотидну послідовність вихідної НК. Після цього синтезуються два коротких ДНК-зонда або праймера, які комплементарні певним ділянкам НК-мішені. Праймер √ самий головний елемент у ПЛР, що забезпечує запуск═ та специфічність реакції. Таким чином, тест-система для ПЛР═ складається з суміші НК дослідного зразка, праймера, дезоксірібонуклеотидів (набора нуклеотидтрифосфатів) та термостабільної ДНК полімерази (ензима═ термофільних бактері 616f56bg й Termus aquaticus). Вищевказану реакційну суміш піддають═ повторним циклам нагрівання/охолодження для денатурації (при нагрівання) НК та гібридізації або віджигу (при охолодженні) праймері 616f56bg в з метою синтеза (за допомогою ДНК-полімерази) нових НК (див. додаток 2).
Цільові навчальні═ завдання 1. Які плазміди містять гени, що детермінують синтез ферментів, які руйнують антибактері 616f56bg альні препарати (наприклад, антибіотики)? А. R-плазміди B. F-плазміди С. Трансмісивні плазміди Д. Плазміди патогенності Е. Всі вище перераховані 2. Яке з визначень є правильним для кон▒югації? А. передача генетичного═ матері 616f56bg алу (хромосомного та плазмідного), відбувається безпосереднім контактом через місток між клітинами донора та реціпієнта В. процес взаємодії фагів з бактерями, що закінчується═ дуже часто їх руйнуванням С. перенос═ генетичного матері 616f56bg алу , що заключається в тому, що═ бактері 616f56bg я-реціпієнт захоплює (поглинає)═ з зовнішнього середовища═ фрагменти чужорідної ДНК Д. перенос генетичного матері 616f56bg алу від клітини донора═ клітині-реціпієнту за допомогою бактері 616f56bg офагів Е. жодне з═ визначень невірне 3. Яке з визначень є правильним для трансдукції? В. процес взаємодії фагів з бактерями, що закінчується═ дуже часто їх руйнуванням С. перенос═ генетичного матері 616f56bg алу , що заключається в тому, що═ бактері 616f56bg я-реціпієнт захоплює (поглинає)═ з зовнішнього середовища═ фрагменти чужорідної ДНК А. передача генетичного═ матері 616f56bg алу (хромосомного та плазмідного), відбувається безпосереднім контактом через місток між клітинами донора та реціпієнта Д. перенос генетичного матері 616f56bg алу від клітини донора═ клітині-реціпієнту за допомогою бактері 616f56bg офагів Е. це здатність бактері 616f56bg альної клітини поглинати═ ДНК 4. Від хворого Н. був взятий матері 616f56bg ал в якому виявили ДНК мікоплазм. Який з перерахованих методів був використаний? А. фаготипування В. реакція фаголізису С. полімеразна ланцюгова реакція Д. метод Отто 5. Завдяки яким особливостям бактері 616f56bg офаги═ викорисовуються з лікувально-профілактичною метою? А. специфічність дії В. літична дія на бактері 616f56bg ї С. токсичність Д. неспецифічність дії Е. всі вище перераховані 6. За характером взаємодії з бактері 616f56bg альною клітиною розрізняють вірулентні та помірні фаги. Що характерно для вірулентного фагу? А. Уражують чутливі до них бактері 616f56bg ї, розмножуються═ в них і виділяються в середовище при лізісі клінтини В. Уражують чутливі до них бактері 616f56bg ї, викликають лізіс тільки однієї частини бактері 616f56bg й з утворенням вегетативного фагу С. Уражують не чутливі до них бактері 616f56bg ї,═ не розмножуються, залищаються в сімбіотичному═ стані і не викликають лізіс бактері 616f56bg й. Е. Жодно з відповідей невірна. 7. Надбана лікарська стійкість може виникати і розповсюджуватися═ в бактері 616f56bg альній популяції═ в результаті: А. відсутності відповідної мішені (наприклад, клітинної стінки) В. переносу трансмісивних плазмід═ резистентності (R-плазмід) С. бактері 616f56bg альної непроникненості для антибіотиків Д. Всі вищеперераховані відновіді 8. Основними ускладеннями при антимікробній хіміотерапії з боку макроорганізму є: А. токсична дія препаратів В. дисбіоз С. алергічні реакції Д. ендотоксичний шок Е. пригнічення імунної системи F. всі вищеперераховані відповіді 9. Дифтері 616f56bg йна паличка═ має здатність продукувати дифтері 616f56bg йний ендотоксин. Наявність якої структури обумовлює цю властивість у данного вида бактері 616f56bg й? А. наявність плазміди В. навяність профагу С. наявність коліцинів Д. жодна з відновідей невірна 10. За допомогою якого досліду можна визначити видову приналежність або═ фаготип досліджуваної культури, ═встановити джерело═ і шляхи розповсюдження інфекції. А. фаготипування В. антибіотикограми С. зараження лабораторних тварин Д. серологічного методу діагностики Е. реакції фаголізісу
Технологічна карта заняття
Додаток 1 ПОЯСНЕННЯ ДО САМОСТІЙНОЇ РОБОТИ З ТЕМИ: " БАКТЕРІОФАГИ ТА ЇХ ПРАКТИЧНЕ ВИКОРИННЯ. ГЕНЕТИКА БАКТЕРІЙ.■
Додаток 2. Графи логічної структури теми: └БАКТЕРІОФАГИ ТА ЇХ ПРАКТИЧНЕ ВИКОРИННЯ. ФОРМИ МІНЛИВОСТІ МІКРООРГАНІЗМІВ. ГЕНЕТИЧНІ РЕКОМБІНАЦІЇ: ТРАНСФОРМАЦІЯ, ТРАНСДУКЦІЯ, КОН▒ЮГАЦІЯ.■ Перевага методу ПЛР √ полімеразної═ ланцюгової реакції для діагностики інфекційних захворювань
|
