Полимеразная цепная реакция
создание документов онлайн
Документы и бланки онлайн

Обследовать

Администрация
Механический Электроника
биологии ботаника
география
дом в саду
история
литература
маркетинг
математике
медицина
музыка
образование
психология
разное
художественная культура
экономика




















































Полимеразная цепная реакция

биологии


Отправить его в другом документе Tab для Yahoo книги - конечно, эссе, очерк Hits: 1192


дтхзйе дплхнеофщ

Закон онтогенетического старения и обновления, или закон Кренке
РОЗМНОЖЕННЯ МІКРООРГАНІЗМІВ. КУЛЬТУРАЛЬНІ ВЛАСТИВОСТІ БАКТЕРІЙ. ФЕРМЕНТИ МІКРООРГАНІЗМІВ, МЕТОДИ ЇХ ВИЯВЛЕННЯ. АНТИБІОТИКИ.
ОПОРНО-ДВИГАТЕЛЬНЫЙ АППАРАТ
Базальные тельца. Строение и движение ресничек и жгутиков.
Морфологическая гетерогенность лизосом
Везикулярный перенос: эндоцитоз и экзоцитоз
НЕРВНАЯ СИСТЕМА ХРЯЩЕВЫХ РЫБ
КРОВЕТВОРЕНИЕ
Самоорганизация системы микротрубочек
 

Полимеразная цепная реакция.

Кари Б. Мюллис – изобретать полимеразной цепной реакции (ПЦР); 1993 – нобелевская премия по химии, 1985 – патент фирмы Cetus Corp California.

ПЦР – цикл 1 (рис. 23).

1.                             ДНК – образец нагревают до 940С (для получения одноцепочечных ДНК) (денатурация).

2.                             В реакционную смесь добавляют короткие последовательности РНК-праймеры, которые ограничивают участок считывания информации (ампликон), кроме праймеров добавляют ДНК-зависимую ДНК – 848e46hi полимеразу термостабильную, снижают температуру сначала до 50 – 650С для того, чтобы образовались водородные связи между праймерами и одноцепочечной ДНК, а затем нагревают до 720С, чтобы термостабильная ДНК-полимераза делала как можно меньше ошибок при присоединении комплиментарных оснований. В результате первого цикла образуются 2 копии ампликон. Цикл повторяют многократно. После 6 циклов ПЦР образуется 64 идентичных копии исходного ампликона (генетического локуса).



Рис. 23. Первый цикл ПЦР

Компоненты, необходимые для ПЦР

1)      Объём пробы – 0,5 – 50 мкл

2)      Анализируемая ДНК – 50 – 100 нмолей, 0,1 – 0,25 мкл (до 1 молекулы в пробе)

3)      Термостабильная ДНК  -полимераза

4)      4 Дезоксирибонуклеозидтрифосфата (4 dNTPs – dATP, dGTP, TГP, dСТР) – 0,2 мМ

5)      Олигонуклеотидные праймеры – длина 17 – 25 н.п. (0,5 – 1,0 мкМ)

6)      Буферный раствор

Термостабильная ДНК-полимераза (Taq ДНК-полимераза).

Особенности:

1)      5/→3/ эндонуклеазная активность (может отщеплять в эту сторону)

2)      Отсутствие 3/→5/ экзонуклеозной активности

3)      высокая термостабильность (время полужизни: 2 часа при 950С)

4)      скорость синтеза ДНЕ примерно 50 нт/сек при 720С

Критические характеристики ПЦР (наиболее важные)

1.      Специфичность

2.      Точность синтеза ДНК

3.      Эффективность

Специфичность.

·        В неоптимальных условиях при амплификации образуются неспецифические продукты ПЦР (шмир, дополнительные полосы)

·        Электрофорез в агарозном геле, окраска бромистым этидием

·        Важно соблюдать температурный и временный режим для соблюдения специфичности.

·        Для уменьшения неспецифичности применяют ПРЦ с «горячим стартом».

·        Обратимая инактивация Taq-ДНК-полимеразы резко увеличивает специфичность ПЦР.

·        Добавление некоторых соединений в реакционную смесь (DMSO, бетаин, 2-пирролидон) приводят к тому же эффекту.

Применяют другие термостабильные ДНК-полимеразы, например, Pfu-ДНК-полимеразы, которые дают меньше ошибок, даже смесь Pfu и Taq и то, более меньше ошибка.

Методы ПЦР.

1.      Ассиметричная

·        Амплификация с использованием преимущественно одного праймера

·        Один из праймеров в меньшей концентрации

·        В основном образуются одноцепочечные продукты ПЦР

·        Линейное увеличение продукта ПЦР

2.      Множественная ПЦР (Multiplex PCR) – одновременная амплификация нескольких ампликонов в одной пробирке (используется для обнаружения патогенных микроорганизмов).

3.      «Гнездовая ПЦР» (Nested PCR) – когда нужно получить короткий ампликон, но он не очень специфичен. Используются 2 пары праймеров: первая пара ограничивает большой фрагмент ДНК, а вторая пара ограничивает малый фрагмент ДНК внутри первого.

4.      Long PCR или LA PCR – амплификация больших участков ДНК с высокой точностью




·        Амплификация участков ДНК до 200 т.п.о. (целых эукариотических генов и вирусных геномов)

·        Использование смесей из двух ДНК-полимераз, одна из которой обладает 3/→5/ -экзонуклеазной активностью

·        Использование высокоочищенного dNTP0.

5.      Аллель – специфическая ПЦР

Принцип действия аллель специфических парймеров:

Элонгация праймера происходит только в том случае, если его 3/-концевой нуклеотид комплиментарен матричной ДНК.

Если последовательность оснований в области мутаций известна, то её образование с помощью аллельспецифических нуклеотидов. Для этого синтезируют олигонуклеотидные зонды, содержащие около 19 нуклеотидов, комплиментарных участкам нормального и комплиментарного аллеля ДНК. Область генома, содержащего исследуемый ген амплифицируют с помощью ПЦР в присутствии каждого из праймеров.

Образцы полученной дНК переносят на специальные фильтры и выдерживают с меченными зондами у гомозигот ДНК будет гибридизоваться только с зондом, комплиментарным мутантной последовательности. ДНК нормального гомозиготного индивидуума свяжется с зондом неизменной нуклеотидной последовательности, а ДНК гетерозигот будет гибридизовать оба зонда.

6.      Иммуно – ПЦР (IPCR)

1)      ДНК – матрица конъюгирована с молекулами иммуноглобулинов, специфичных в отношении анализируемого антигена.

2)      Конкурентная иммуно-ПЦР: конъюат лиганда с ДНК-матрицей конкурирует со свободным лигандом за АТ.

3)      1000 – кратное увеличение стандартного иммуносодержащего ферментного сигнала

7.      Случайная амплификация полиморфных последовательностей (метод RAPG).

8.      ПЦР in situ: амплификация участков ДНК или РНК  в интактных клетках.

Фиксация 10% формалином клеток и тканей, помещение в парафиновые блоки, премеабилизация клеточных мембран протеиназами (пепсин), их удаление диэтилпирокарбонатом, амплификация с биотинилированными нуклеотидами, детекция.

1. Позволяет:

1) Локализовать анализируемые последовательности во внутриклеточном пространстве

2)Обнаруживать 1 копию последовательности на фоне 1 μg ДНК, уникальные гены и их транскрипты

2. Находит широкое применение в вирусологии, онкологии и биологии развития

Недостатки ПЦР, проводимой в обычном формате:

  1. Необходимость анализа продуктов ПЦР после завершения реакции

а) Электрофорез

б) Гибридизация и т.п.

  1. Опасность кроссконтаминаций продуктами ПЦР
  2. Невозможность количественной оценки содержания амплифицируемой матрицы в анализируемых образцах

 Обычная ПЦР не позволяет определять количество матричной ДНК или РНК в пробе

Ø      Ни одна из стадий ПЦР не завершается с эффективностью 100%

Ø      Накопление ингибиторов ПЦР при прохождении реакции

Ø      Наименее эффективны завершающие циклы

Ø      Решение проблемы с помощью ПЦР в реальном времени

9.      Колличественная ПЦР

ПЦР в реальном времени

 Позволяет, не открывая пробирки, непрерывно следить за накоплением продуктов ПЦР в пробах

Для ПЦР в реальном времени необходим синтез специальных зондов, имеющих флуоресцентную метку.